質譜同位素輪廓分布信息幫助確定化合物的分子式
質譜法是鑒定未知化合物的重要手段。在有譜庫輔助的前提下，我們可以通過譜庫檢索來快速確定目標物可能的幾個疑似候選物，然后在標準品對照的情況下，通過保留時間信息、質譜圖來對疑似物進行驗證以確定真正的目標。在沒有譜庫時，就需要測定目標化合物的精確質量數，然后對可能的分子式進行預測（見圖1），再通過二級或多級質譜的碎片信息來探索可能的結構。
圖1： 精確質量數推導可能的元素組成（分子式）
雖然高分辨質譜在高質量精度下已經將精確質量數測定得盡可能準確，但是還是不足以幫助我們解決分子式的鑒定問題。因為當未知化合物的分子量很大時，匹配在測定精確質量誤差范圍內的可能元素組成數量也會增加；盡管高分辨質譜擁有極高的質量精度，但是仍然會存在很多不能排除的可能元素組成。Tobias Kind和Oliver Fiehn在2006年發表的一篇文章中，總結了在僅考慮C、H、N、O、S五種元素的情況，不同分子量大小的化合物在不同質量精度下的可能元素組成的個數，如圖2所示，即使質量精度達到FT-MS的0.1 ppm以內，隨著分子量的增大，元素組成的可能性越來越多。因此，僅靠質譜的高質量精度，往往并不能確定一個唯一的元素組成，尤其是當要考慮到更多的元素時。
圖2： 不同質量精度下的元素組成個數
（數據來源：Tobias Kind and Oliver Fiehn, BMC Bioinformatics 2006, 7:234）
高分辨質譜上的同位素信息與分子式鑒定
質譜圖上的信息，除了質量數外，還有同位素的豐度信息。Tobias Kind和Oliver Fiehn在2006年的文章中還證明了同位素比例結合精確質量數在減少可能的元素組成方面比單純依靠更高的分辨率和質量精度更占優勢。圖3顯示了C25H23N2OS+在0.1ppm質量精度下，共有7個可能的分子式，排除掉2個Na元素個數不對的分子式，仍然有5個分子式，對比這5個分子式的理論同位素輪廓分布，我們可以看到它們同位素輪廓分布存在顯著差異（見圖4），因此只要將理論的同位素輪廓與測試譜圖的同位素輪廓進行比對，就能確定出真正的分子式。
圖3：FT-MS在0.1ppm質量精度下得到的C25H23N2OS+可能分子式
（數據來源：Yongdong Wang and Ming Gu. Anal. Chem. 2010, 82, 7055–7062）
圖4：五個候選分子式在A+1處的理論同位素輪廓分布（MS分辨率=80萬）
（數據來源：Yongdong Wang and Ming Gu. Anal. Chem. 2010, 82, 7055–7062）
但實際的質譜譜圖由于儀器本身等因素的影響，導致實驗譜圖的峰型發生了變形，從而會使得同位素輪廓的比對會產生5%以上的譜圖誤差，這對于區分一些同位素豐度比差異接近的分子式并不容易。在MassWorks軟件中，不只是簡單地將實驗譜圖和理論譜圖進行對比，而是用獨特的峰形校正技術去除噪音等畸變因素，以得到跟理論譜圖一樣的對稱分布的輪廓曲線。用這種校正譜圖跟理論譜圖做對比，可以將同位素分布的譜圖誤差縮小至2%以內，進一步提升利用同位素輪廓區分分子式差異的準確度。如圖5所示，m/z=844.5067的化合物在TOF儀器上，在4ppp的質量精度下共有75個可能的分子式，盡管排名第一的分子式的質量誤差并不是最小的，但是它的校正譜圖和理論譜圖的同位素譜圖準確度（Spectral Accuracy）最佳，證明了該分子式為正確的分子式；而排名第2的分子式可以明顯觀察到由于S元素的影響使得理論譜圖比樣品的校正譜圖在A+2處的豐度要高，譜圖的誤差為2.6%左右。
John C. L. Erve在2009年和2011年發表的文章中，分別驗證了在LTQ/Orbitrap和Q-TOF上利用MassWorks的峰形校正技術確定分子式的優越性，尤其是在Orbitrap上，分子量大于900的化合物，譜圖準確度可以幫助消除99%以上的分子式。
圖5：TOF在4ppm誤差內，Top 2分子式的理論譜圖和校正譜圖的譜圖準確度對比
高分辨質譜可以通過精確質量數據和同位素分布信息來確定未知化合物的分子式，那么低分辨質譜，如四極桿質譜，是不是也可以這樣做呢？
可以！
四極桿質譜上的分子式測定
MassWorks軟件的TrueCal?校正技術可以將四極桿質譜的質量精度提高100倍以上，從而使其獲得精確質量數的測定能力，再借助CLIPs技術就能準確測定未知化合物的元素組成，這一技術已經在數千個客戶處得到了驗證。
四極桿質譜的分辨率盡管不如高分辨質譜，但是它測定同位素豐度的穩定性是優于高分辨質譜的，而且更寬的線性范圍，可以保證高、低豐度的同位素都能被準確檢測。圖4中的高度分離的不同元素的同位素，在四極桿質譜上表現為這幾個元素的疊加，我們依然能清晰的區分出這5個分子式的同位素輪廓分布的差異，因此，在四極桿質譜上通過精確質量數結合同位素分布一樣能鑒定出未知物的分子式。
圖6：五個候選分子式在四極桿質譜上的理論同位素輪廓分布（MS分辨率=800）
（數據來源：Yongdong Wang and Ming Gu. Anal. Chem. 2010, 82, 7055–7062）
圖7（上）顯示GC/MS測定的m/z=164的化合物，在10mDa的誤差內，共有6個分子式，但它們的同位素分布的譜圖準確度存在明顯差異，圖7（下）清晰顯示了前3個分子式的理論同位素與實測校正譜圖的對比，結果表明正確的分子式即為第一個分子式C10H12O2。
圖7：GC/MS上測定精確質量數和分子式
（數據來源：Wei Zhou and Yaheng Zhang,Rapid Commun. Mass Spectrom. 2011, 25, 3097–3102）
關于MassWorks 軟件
MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開發的一款革命性的MS數據定性分析軟件，能幫助我們在低分辨率的四極桿GC/MS、LC/MS直接測定化合物的精確質量，并通過獨有的譜圖準確度概念確定出準確的分子式。MassWorks軟件同樣適用于高分率質譜（TOF、Orbitrap）的定性分析。
關于綠綿科技
綠綿科技是Cerno Bioscience公司在中國區的總代理商，負責Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等產品市場推廣、銷售、售前/售后技術支持、應用支持。
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